醫(yī)療污水處理過程中的微生物檢測標準及方法解析
【西安純水設備http://www.108clf.cn】在抗擊新型冠狀病毒疫情過程中，已于確診病例糞便中檢測到病毒核酸陽性，國家衛(wèi)健委專家提示新冠肺炎有糞口傳播的可能性，并在某些特殊的條件下才發(fā)生氣溶膠傳播。針對這一問題，生態(tài)環(huán)境部發(fā)布《關于做好新型冠狀病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作的通知》，要求進一步加強醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作，防止新型冠狀病毒通過污水擴散傳播。
為什么需要如此重視醫(yī)療污水和城鎮(zhèn)污水監(jiān)管工作呢？美國PM Gundy的研究團隊曾在《Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater》一文中指出，水體中的有機物和懸浮固體可以吸附冠狀病毒，為病毒的存活提供了保護。同時，從污水流向的我們不難看出，糞便最終排到了污水處理廠，這些可能攜帶新型冠狀病毒的廢水，在污水處理中形成攜帶病毒的氣溶膠，從而形成了氣溶膠傳播的環(huán)境，使污水處理人員成為感染風險較大的群體，對阻止疫情傳播有很大的影響。因此，醫(yī)療機構、污水處理機構及環(huán)境監(jiān)測部門，都是控制病毒通過污水傳播的關鍵。
目前，為有效防止新型冠狀病毒通過糞便和污水擴散傳播，生態(tài)環(huán)境部門要求對要接收新型冠狀病毒感染的肺炎患者或疑似患者診療的定點醫(yī)療機構（醫(yī)院、衛(wèi)生院等）、相關臨時隔離場所及研究機構，嚴格執(zhí)行《醫(yī)療機構水污染物排放標準》，并參照《醫(yī)院污水處理技術指南》、《醫(yī)院污水處理工程技術規(guī)范》和《新型冠狀病毒污染的醫(yī)療污水應急處理技術方案（試行）》等有關要求，對污水和廢棄物進行分類收集和處理，確保穩(wěn)定達標排放；同時，地方生態(tài)環(huán)境部門要督促城鎮(zhèn)污水處理廠切實加強消毒工作，結合實際，采取投加消毒劑或臭氧、紫外線消毒等措施，確保出水糞大腸菌群數指標達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》要求。
通過對比以上標準發(fā)現，在這些污水處理過程中，糞大腸菌群數是評判污水處理是否合格的關鍵微生物指標。研究表明，污水中糞大腸菌群數量與腸道致病菌數量存在相關關系，當污水中糞大腸菌群數超過1174個/L時，即可在污水中檢出病原菌，因此將糞大腸菌群數作為特征指示性指標對這些微生物進行控制。
根據檢測方法、應用領域和污染情況的不同，各標準中對糞大腸菌群數的限量也不同（表1）。目前，可用于檢測水體中糞大腸菌群數的方法有4種，分別是多管發(fā)酵法、膜過濾法和快速熒光檢測法、酶底物法，其中前三種認可度較高，且使用較廣泛。
1 膜過濾法
膜過濾法是目前最常用于水體中糞大腸菌群數檢測的一種標準方法，也是《新型冠狀病毒污染的醫(yī)療污水應急處理技術方案（試行）》中的指導方法，可于地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水及醫(yī)療污水等樣本的檢測。
該方法使樣品通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度(44.5℃)下培養(yǎng)24h，膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，糞大腸菌群能生長并發(fā)酵乳糖產酸使指示劑變色西安水處理設備，通過顏色判斷是否產酸，并通過對呈藍色或藍綠色的菌落進行計數，從而測定樣品中糞大腸菌群濃度。
膜過濾法的關鍵在于樣品前處理，需借助抽濾裝置才可完成，使微生物被截留在無菌濾膜上，并通過物理的方式進行富集，以保證糞大腸菌以菌落形態(tài)被檢出。目前，市面上已有較為成熟、有效的的水中膜過濾裝置，可用于水體中微生物前處理操作。
專為水質樣品前處理、富集等操作設計；
結構精巧，配合精密抽濾泵，保證良好的抽濾效果；
不銹鋼材質，可高溫高壓滅菌，避免交叉污染；
直抽直排，防止廢液倒吸。
2 多管發(fā)酵法
多管發(fā)酵法又稱最大可能數（most probable number，MPN）法或稀釋培養(yǎng)計數法，該方法是用于檢測地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測定中糞大腸菌群數的一種標準方法。
經培養(yǎng)后產生的目標微生物陽性數，查表估算一定體積樣品中目標微生物存在的數量（即單位體積存在目標微生物的最大可能數）。
采用多管發(fā)酵法時，先將樣品加入含乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中，37℃初發(fā)酵富集培養(yǎng)，大腸菌群在培養(yǎng)基中生長繁殖分解乳糖產酸產氣，產生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變?yōu)辄S色，產生的氣體進入倒管（杜氏小管）中，指示產氣。然后再44.5℃復發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的膽鹽三號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，最后產氣的細菌確定為是糞大腸菌群。最后通過查MPN表，即可得出糞大腸菌群濃度值。
實驗小貼士
該方法在操作過程中，根據樣品檢出限的不同，可選擇12管法（檢出限為3MPN/L）或15管法（檢出限為3MPN/L）進行實驗，因此需要大量使用試管和液體培養(yǎng)基（每個樣品需準備12或15支試管）。若檢測樣品量較大時，建議可采用培養(yǎng)基分液器來降低工作量。
可用于生理鹽水、液體及半固體培養(yǎng)基自動分裝；
1L溶液分裝到100個MPN法試管中，最快僅需2分鐘；
微電腦系統(tǒng)與精密泵體聯合控制，分裝精度高；
分裝量、分裝速度、分裝時間、停頓時間、分裝次數等參數可自由設定。
采用自動微生物試劑分液器進行實驗用品準備，不僅能實現準確的連續(xù)分裝，還可在保證進度的同時，大大降低工作量。
3 快速熒光檢測法
快速熒光檢測法是一種利用ATP熒光原理與微生物特性相結合的快速檢測方法，雖然該方法暫未被納入國家標準中，但由于其操作方便，檢測與培養(yǎng)時間短（僅為膜過濾法、多管發(fā)酵法的1/3），目前被很多大型企業(yè)作為內部微生物自檢的一種重要手段。通過與對應的采樣、增菌拭子配合使用，可快速檢測水體中糞大腸菌群數量。
快速熒光檢測法是在熒光素酶（lueiferase）和Mg2+的作用下，熒光素（lueiferin）與ATP發(fā)生腺苷酰化反應后被活化，活化的熒光素與熒光素酶相結合，形成了熒光素-AMP復合體焦磷酸（PPi）。該復合物在氧化作用下，產生熒光信號。通過ATP檢測液檢測微生物ATP的發(fā)光量，達到檢測細菌的目的。該方法現已獲得AOAC研究機構的檢測方法性能擔保認證。
目前，杭州大微已開發(fā)了DW-ES800型微生物實時檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于ATP熒光快速檢測法，采用雙模塊設計，實現對水體中糞大腸菌群、大腸菌群、大腸桿菌、細菌總數等多種微生物的檢測和計數。
耗時短：培養(yǎng)時間短（定性8小時，定量1~8小時），檢測時間僅需15秒
范圍廣：細菌總數、大腸桿菌、總大腸菌群、糞大腸菌群等多種微生物
效率高：雙培養(yǎng)通道，可同時培養(yǎng)不同溫度微生物
易操作：五步即可完成（增菌拭子采樣→培養(yǎng)→轉移→檢測拭子激活→檢測）
可將RLU值轉換為CFU值
4 酶底物法
酶底物法是檢測水體中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的一種標準方法。該方法是利用在特定溫度下培養(yǎng)特定的時間西安水處理設備，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產生特定的β-半乳糖苷酶將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為鄰硝基酚（ONP），呈黃色反應；且大腸埃希氏菌同時又能產生β-葡萄糖醛酸酶將選擇性培養(yǎng)基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下呈熒光反應。統(tǒng)計陽性反應出現數量，查MPN表，再除以接種樣品的稀釋度。計算相應水樣中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。由于操作起來較為繁瑣，工作量巨大，故在日常檢測中很少被使用。西安純水設備，西安水處理設備，西安去離子水設備。醫(yī)院用純水設備
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